iSynBio造物聯(lián)合合成生物學競賽推出《大賽項目揭秘專題》，本期為第九期，嘉賓為廈門大學Synbio-XMU團隊，參賽項目為PTC疫苗有望挑戰(zhàn)所有病毒？

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項目內(nèi)容概述

在病毒的基因組多個基因位點突變成終止密碼子的序列，使得病毒在人體中的翻譯提前終止，無法產(chǎn)生完整的子代病毒。這種含有提前終止子PTC (Premature termination codon) 突變的病毒基因組和正常的病毒蛋白可以組裝出類病毒顆粒，即PTC類病毒或PTC疫苗。它沒有病毒毒性，但能引起人體產(chǎn)生高效免疫的武器。但現(xiàn)有PTC疫苗均無法突破在實驗室難以大量生產(chǎn)的問題。本項目首先設(shè)計并構(gòu)建了能識別終止密碼子的ACE-tRNA，若將其引入酵母細胞，可以利用含有PTC位點的病毒基因組合成正常的病毒蛋白，有望解決PTC疫苗生產(chǎn)問題。

隨后，本項目通過PTC-GFP（含有提前終止子突變的GFP）作為報告基因驗證了識別終止密碼子的ACE-tRNA的有效性。同時還用Cas9技術(shù)改造了酵母的工程菌株。后續(xù)將以腸道病毒EV71為例，嘗試利用酵母細胞生產(chǎn)EV71-PTC疫苗。這些PTC疫苗生產(chǎn)工藝的改進有望應用到更多致病病毒相關(guān)的PTC疫苗開發(fā)。希望我們開發(fā)的PTC疫苗制備方法能促進疫苗學的研究，為全球公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展和新冠疫苗的研發(fā)提供新的方案。

項目背景

據(jù)世衛(wèi)組織公布的數(shù)據(jù)，截止2022年6月16日，全球共有超過200多個國家/地區(qū)累計新冠確診病例5.352億例，疫苗研發(fā)成為世界關(guān)注的焦點。目前五條疫苗研發(fā)技術(shù)路線，分別為滅活疫苗、減毒活疫苗、核酸疫苗、腺病毒載體疫苗和重組蛋白疫苗，但開發(fā)周期都比較長。PTC疫苗具有通用性，適用于多種病毒，可以通過多點突變的方式，快速研發(fā)，特別是急性感染病毒的疫苗開發(fā)有獨特的潛力。PTC疫苗為疫苗研發(fā)提供了新思路。

反密碼子編輯tRNA（ACE-tRNA，anticodon engineered transfer RNA）指反密碼子環(huán)序列經(jīng)過人為改造的tRNA。本項目將絲氨酸Ser的tRNA的反密碼子改造為終止密碼子（UAG、UGA、UAA）。這三種ACE-tRNA能夠?qū)TC位點引入絲氨酸Ser，避免提前終止而產(chǎn)生正確的蛋白。將ACE-tRNA引入酵母細胞，則能將含有PTC位點的病毒基因組翻譯出正確的病毒蛋白，進而用于制備PTC疫苗。

無義介導的mRNA降解(NMD, nonsense-mediated mRNA decay)是指在病理或正常生理情況下mRNA上出現(xiàn)了提前終止密碼子(PTC)，從而導致mRNA降解的現(xiàn)象。它是一種廣泛存在的mRNA質(zhì)量監(jiān)控機制。mRNA在有提前終止密碼子PTC存在時，翻譯產(chǎn)生的截短蛋白往往具有細胞毒性，NMD的存在有助于避免截短蛋白的產(chǎn)生。為了提高外源基因mRNA（含有PTC位點）的穩(wěn)定性，本項目開發(fā)了缺失NMD途徑的酵母底盤菌株。

項目總體技術(shù)路線

技術(shù)路線圖

1）正常的病毒基因組（不含PTC位點），能翻譯正常病毒蛋白，具有毒性和免疫原性。含有PTC位點的病毒基因組，只能翻譯出截斷的病毒蛋白，無法組裝出病毒。

2）含有PTC位點的病毒基因組，在有ACE-tRNA存在的情況下，能翻譯出正常的病毒蛋白。含有PTC位點的病毒基因組和正常的病毒蛋白可以組裝出PTC類病毒，即PTC疫苗。

3）利用Cas9技術(shù)敲除NAM7基因獲得缺失NMD途徑的酵母菌株，含有PTC位點外源基因的mRNA不容易被降解。

項目主要成果

1.設(shè)計并構(gòu)建識別終止密碼子的ACE-tRNA

考慮到酵母中終止密碼子UAG、UAA、UGA密碼子豐度不同，我們將絲氨酸t(yī)RNA的反密碼子環(huán)設(shè)計為分別含有三種終止密碼子的ACE-tRNA。實驗中，我們將絲氨酸t(yī)RNA的基因克隆出來連接到質(zhì)粒載體上，并引入終止密碼子相應的TAA、TGA、TAG突變，將三種突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得轉(zhuǎn)化子。（見下圖）

三種ACE-tRNA基因

(含終止密碼子相應的突變)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子

2.篩選對酵母毒性較小的ACE-tRNA

除了與外源基因的PTC位點的終止密碼子結(jié)合之外，三種ACE-tRNA還可能與酵母正常基因mRNA的終止密碼子結(jié)合，從而導致酵母蛋白的翻譯不能正確停止，產(chǎn)生大量無法正常終止而過長的無用蛋白，進而影響酵母生長速度，因此生長曲線的測定可以間接反映ACE-tRNA與正常終止tRNA的競爭情況。實驗表明UAA突變版本的ACE-tRNA對酵母毒性相比于UAG和UGA的更小。（見下圖）

三種突變long-tRNA與對照組OD600變化比較

3.構(gòu)建報告基因突變版的GFP驗證ACE-tRNA的有效性

為了驗證ACE-tRNA的有效性，我們構(gòu)建了將第147位點突變?yōu)榻K止密碼子的綠色熒光蛋白GFP，即PTC-GFP作為報告基因。將PTC-GFP和ACE-tRNA共轉(zhuǎn)到酵母細胞中，預期能夠成功翻譯終止密碼子的tNRA產(chǎn)出綠色熒光蛋白（見下圖）。但是，共轉(zhuǎn)的各實驗組中均未能觀察到明顯綠色熒光，僅有較弱的綠色熒光。經(jīng)過分析酵母的NMD途徑的存在可能是共轉(zhuǎn)實驗未能得到較強的綠色熒光的原因。

報告基因PTC-GFP和ACE-tRNA共轉(zhuǎn)到酵母

示意圖

4.構(gòu)建缺失NMD途徑的酵母作為PTC類病毒的生產(chǎn)底盤菌

利用cas9技術(shù)敲除NMD途徑關(guān)鍵基因NAM7（見下圖紅框）。

NAM7基因敲除的酵母細胞鑒定圖

隨后，在缺失NMD途徑的酵母中，共轉(zhuǎn)ACE-tRNA和PTC-GFP，獲得到較強的綠色熒光，相同條件下WT酵母菌株僅有極低的熒光效果（見下圖），相關(guān)數(shù)據(jù)圖標還在統(tǒng)計中?？梢娫谌笔MD途徑的酵母菌株中外源基因（含有PTC位點）的mRNA不容易被降解。

ACE-tRNA與PTC-GFP

共轉(zhuǎn)NMD途徑敲除的酵母

（左側(cè)是缺失NMD途徑敲除的菌株；中部是酵母WT菌株；右側(cè)是陰性對照）

鑒于目前的實驗結(jié)果，后續(xù)需對PTC類病毒顆粒的表達方案展開探究，檢測病毒免疫原性、進行動物實驗驗證PTC疫苗的有效性。后續(xù)也可借助tRNA的定向進化篩選出更高效的ACE-tRNA版本，為PTC疫苗研究提供重要思路。

項目完整內(nèi)容（Wiki網(wǎng)頁）

http://www.synbiochallenges.com/wiki/2021/SynBioC_XMU/Protocol.html

我們是來自廈門大學的

Synbio-XMU團隊

王子傲（隊長）

廈門大學生命科學院學院本科生

魏翹楚

廈門大學公共衛(wèi)生學院本科生

張丹麗

廈門大學生命科學學院研究生

吳娜

廈門大學生命科學學院本科生

夏伊瀾

廈門大學公共衛(wèi)生學院本科生

曹宇

廈門大學公共衛(wèi)生學院本科生，喜歡各類體育運動。

吳瀅潔

廈門大學信息學院軟件工程專業(yè)本科生

霍子軒

化學化工學院18級化學生物學系 Per Aspera Ad Astra

萬澄雨

廈門大學醫(yī)學院口腔醫(yī)學系2021級本科生

伍桐瑤

很開心能跟大家一起頭腦風暴，一起做實驗，一起進步！

陳智超

嘿呦what's up man~

劉桂杉

一個對世界充滿好奇心的未來醫(yī)生。

劉元媛

生活奇奇怪怪，而我可可愛愛。

馬躍

廈門大學20級生物科學交流生

陳權(quán)欣

清醒時做事，糊涂時讀書;

大怒時睡覺，獨處時思考。

#指導老師

袁吉峰

廈門大學生命科學學院

閩江學者特聘教授

#指導顧問

商志云

張子鈺

合成生物學是生命科學領(lǐng)域一門新興的前沿交叉學科和典型的匯聚技術(shù)。它通過融合工程科學理念與生命科學原理及基于多學科的使能技術(shù)，設(shè)計合成新的或改造天然的生命系統(tǒng)，揭示生命規(guī)律、構(gòu)筑新一代工程生物體系；被喻為“認識生命的鑰匙”（造物致知）、改變未來的顛覆性技術(shù)（造物致用）。

合成生物學競賽-創(chuàng)新賽主要面向在校大學生以及在讀碩士研究生。本屆創(chuàng)新大賽包括醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、制造、信息、基礎(chǔ)研究及創(chuàng)新應用等多個領(lǐng)域，鼓勵學生從興趣出發(fā)，探索合成生物學在不同領(lǐng)域的創(chuàng)新和應用。首屆創(chuàng)新大賽將于 2022 年 7月9-10日在深圳理工大學線下舉行。

大賽由中國生物工程學會合成生物學分會指導和主辦。大賽由二十多家高校和研究所共同發(fā)起。大賽的共同承辦單位是中國科學院深圳理工大學（籌）合成生物學院、中國科學院深圳先進技術(shù)研究院合成生物學研究所、深圳合成生物學創(chuàng)新研究院、深圳市合成生物學協(xié)會、 深圳市工程生物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心、DeepTech。大賽的支持單位為光明區(qū)委區(qū)政府。

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作者 |Synbio-XMU團隊

校對 |鯤

編輯 |果粒珍珍

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